| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略词 | 第10-12页 |
| 第一章 综述 | 第12-26页 |
| 1.1 辣椒产业发展状况 | 第12-13页 |
| 1.1.1 国内外辣椒现状 | 第12页 |
| 1.1.2 辣椒应用价值、经济意义及发展前景 | 第12-13页 |
| 1.2 辣椒病毒病 | 第13-18页 |
| 1.2.1 辣椒病毒病症状及发生 | 第13-14页 |
| 1.2.2 侵染辣椒的植物病毒 | 第14-18页 |
| 1.2.3 烟草花叶病毒研究现状 | 第18页 |
| 1.3 病毒病检测方法 | 第18-24页 |
| 1.3.1 生物学检测方法 | 第19页 |
| 1.3.2 电子显微镜方法 | 第19-20页 |
| 1.3.3 血清学检测方法 | 第20-22页 |
| 1.3.4 分子生物学检测方法 | 第22-24页 |
| 1.4 本研究意义 | 第24-25页 |
| 1.5 研究内容 | 第25-26页 |
| 第二章 材料与方法 | 第26-44页 |
| 2.1 感病样本采集及ELISA检测 | 第26-27页 |
| 2.1.1 辣椒病样的采集 | 第26页 |
| 2.1.2 ELISA检测 | 第26-27页 |
| 2.2 毒原的分离保存 | 第27-28页 |
| 2.2.1 TMV病毒的单斑分离 | 第27页 |
| 2.2.2 TMV毒原的保存 | 第27-28页 |
| 2.3 TMV分离物CP基因克隆 | 第28-32页 |
| 2.3.1 TMV感病叶片总RNA提取 | 第28-29页 |
| 2.3.2 RT-PCR | 第29页 |
| 2.3.3 PCR产物纯化 | 第29-30页 |
| 2.3.4 DH5α 感受态细胞的制备 | 第30页 |
| 2.3.5 与pMD18-T载体连接及转化大肠杆菌DH5α | 第30-31页 |
| 2.3.6 菌液PCR筛选阳性克隆 | 第31-32页 |
| 2.3.7 提取pMD18T_TMV CP重组质粒 | 第32页 |
| 2.3.8 TMV CP基因测序 | 第32页 |
| 2.4 TMV CP基因表达载体的构建 | 第32-34页 |
| 2.4.1 从pMD18T_TMV CP上扩增CP基因 | 第32-33页 |
| 2.4.2 CP基因原核表达载体的构建 | 第33-34页 |
| 2.5 TMV CP基因的原核表达 | 第34-37页 |
| 2.5.1 重组CP基因原核表达条件的优化 | 第34-35页 |
| 2.5.2 SDS-PAGE电泳分析 | 第35-36页 |
| 2.5.3 表达产物的可溶性分析 | 第36页 |
| 2.5.4 表达产物(重组蛋白)浓度估计 | 第36页 |
| 2.5.5 抗原制备 | 第36-37页 |
| 2.6 免疫及抗血清制备 | 第37页 |
| 2.6.1 小白鼠初次免疫 | 第37页 |
| 2.6.2 再次免疫 | 第37页 |
| 2.6.3 小白鼠取血清 | 第37页 |
| 2.7 TMV、PMMoV和CMV的三重RT-PCR检测技术 | 第37-40页 |
| 2.7.1 实验材料 | 第38页 |
| 2.7.2 引物设计 | 第38页 |
| 2.7.3 总RNA提取 | 第38页 |
| 2.7.4 反转录合成cDNA | 第38-39页 |
| 2.7.5 单重RT-PCR | 第39页 |
| 2.7.6 多重RT-PCR | 第39页 |
| 2.7.7 多重RT-PCR产物的测序验证 | 第39页 |
| 2.7.8 多重RT-PCR法特异性评价 | 第39-40页 |
| 2.7.9 多重RT-PCR法灵敏度 | 第40页 |
| 2.7.10 田间样品检测 | 第40页 |
| 2.8 TMV的核酸斑点杂交（NASH）检测技术 | 第40-44页 |
| 2.8.1 材料和试剂 | 第40页 |
| 2.8.2 引物设计 | 第40页 |
| 2.8.3 地高辛（DIG）标记TMV杂交探针的制备 | 第40-42页 |
| 2.8.3.1 模板的制备 | 第40-41页 |
| 2.8.3.2 DIG-探针制备 | 第41-42页 |
| 2.8.4 DIG-TMV探针的特异性 | 第42-44页 |
| 2.8.4.1 NASH检测步骤 | 第42-44页 |
| 2.8.5 NASH（DIG-TMV探针）的检测灵敏度 | 第44页 |
| 第三章 结果与分析 | 第44-63页 |
| 3.1 贵阳周边辣椒病毒病初步调查 | 第44-45页 |
| 3.1.1 各主要病毒检出率 | 第44-45页 |
| 3.2 TMV毒原的分离保存 | 第45页 |
| 3.3 TMV-GZ 的分子鉴定 | 第45-51页 |
| 3.3.1 TMV病叶总RNA提取 | 第45-46页 |
| 3.3.2 TMV CP基因的RT-PCR | 第46-47页 |
| 3.3.3 菌液PCR筛选重组pMD18T_TMV CP质粒 | 第47页 |
| 3.3.4 重组pMD18T_TMV CP质粒测序 | 第47-48页 |
| 3.3.5 TMV-GZ CP基因序列及氨基酸序列同源性比对 | 第48-50页 |
| 3.3.6 TMV-GZ分离物CP基因序列构建NJ树 | 第50-51页 |
| 3.4 TMV CP基因的原核表达 | 第51-56页 |
| 3.4.1 pMD 18T_CP重组质粒与pET32a双酶切 | 第51-52页 |
| 3.4.2 pET32a_TMV CP重组质粒菌液PCR筛选 | 第52-53页 |
| 3.4.3 重组菌诱导条件优化 | 第53-55页 |
| 3.4.4 重组蛋白可溶性分析 | 第55-56页 |
| 3.4.5 重组蛋白浓度估计 | 第56页 |
| 3.5 TMV重组CP蛋白抗血清的制备 | 第56-57页 |
| 3.6 辣椒三种病毒的多重RT-PCR同步检测 | 第57-60页 |
| 3.6.1 多重RT-PCR体系优化 | 第57-58页 |
| 3.6.2 多重RT-PCR产物测序验证 | 第58页 |
| 3.6.3 多重RT-RCR的检测特异性 | 第58-59页 |
| 3.6.4 多重RT-RCR检测灵敏度 | 第59-60页 |
| 3.6.5 田间样品检测 | 第60页 |
| 3.7 TMV的核酸斑点杂交（NASH）检测技术研究 | 第60-63页 |
| 3.7.1 地高辛（DIG）标记TMV杂交探针的制备 | 第61页 |
| 3.7.2 NASH检测方法的特异性 | 第61-62页 |
| 3.7.3 NASH检测方法的灵敏度 | 第62-63页 |
| 第四章 讨论 | 第63-66页 |
| 4.1 辣椒病毒病调查 | 第63页 |
| 4.2 TMV的分子鉴定 | 第63页 |
| 4.3 抗血清制备 | 第63-64页 |
| 4.4 三种辣椒病毒的多重RT-PCR同步检测 | 第64-65页 |
| 4.5 TMV的核酸斑点杂交（NASH）检测 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-72页 |
| 攻读硕士研究生期间发表的文章 | 第72页 |
| 附录A 仪器设备 | 第72-73页 |
| 附录B 常用试剂及缓冲液配置 | 第73-76页 |
| 附录C 所用的pET32a(+)原核表达载体(Novagen公司) | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
