| 中文摘要 | 第7-10页 |
| Abstract | 第10-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-36页 |
| 1.1 丙酮酸 | 第14-17页 |
| 1.1.1 丙酮酸应用价值 | 第14页 |
| 1.1.2 丙酮酸制备方法 | 第14-17页 |
| 1.1.3 丙酮酸检测方法 | 第17页 |
| 1-2 L-酪氨酸 | 第17-19页 |
| 1.2.1 L.酪氨酸应用价值 | 第17页 |
| 1.2.2 L-酪氨酸制备方法 | 第17-19页 |
| 1.2.3 L-酪氨酸检测方法 | 第19页 |
| 1.3 乳酸氧化酶 | 第19-26页 |
| 1.3.1 乳酸氧化酶菌属来源 | 第19-20页 |
| 1.3.2 乳酸氧化酶催化机理 | 第20-24页 |
| 1.3.3 乳酸氧化酶应用 | 第24-26页 |
| 1.4 多酶偶联反应体系 | 第26-28页 |
| 1.4.1 自偶联反应体系 | 第27页 |
| 1.4.2 种间偶联反应体系 | 第27-28页 |
| 1.5 本研究目的与意义 | 第28-30页 |
| 参考文献 | 第30-36页 |
| 第二章 多酶偶联生物合成丙酮酸 | 第36-69页 |
| 第一节 乳酸氧化酶基因工程菌的构建及酶学性质研究 | 第36-48页 |
| 1.1 实验材料和仪器 | 第36-37页 |
| 1.1.1 实验试剂 | 第36-37页 |
| 1.1.2 实验仪器 | 第37页 |
| 1.1.3 培养基 | 第37页 |
| 1.2 实验方法 | 第37-41页 |
| 1.2.1 乳酸氧化酶基因工程菌构建 | 第37-39页 |
| 1.2.2 乳酸氧化酶工程菌诱导表达 | 第39-40页 |
| 1.2.3 酶活测定方法 | 第40-41页 |
| 1.3 实验结果 | 第41-46页 |
| 1.3.1 重组质粒pET-Duet-lod构建 | 第41-43页 |
| 1.3.2 乳酸氧化酶酶活测定 | 第43页 |
| 1.3.3 反应温度对酶促反应的影响 | 第43-44页 |
| 1.3.4 反应pH对酶促反应的影响 | 第44-45页 |
| 1.3.5 细胞破碎对LOD酶活的影响 | 第45页 |
| 1.3.6 细胞破碎对反应液中丙酮酸积累的影响 | 第45-46页 |
| 1.3.7 还原剂对丙酮酸积累的影响 | 第46页 |
| 1.4 结论 | 第46-48页 |
| 第二节 乳酸氧化酶和过氧化氢酶一菌双酶基因工程菌的构建 | 第48-58页 |
| 2.1 实验材料 | 第48-49页 |
| 2.2 实验方法 | 第49-52页 |
| 2.2.1 pET-Duet-lod-cat/BL21构建 | 第49-51页 |
| 2.2.2 一菌双酶工程菌诱导表达 | 第51页 |
| 2.2.3 酶活测定方法 | 第51页 |
| 2.2.4 pET-Duet-lod-cat/BL21发酵优化 | 第51-52页 |
| 2.3 实验结果 | 第52-57页 |
| 2.3.1 重组质粒pET-Duet-lod-cat构建 | 第52-53页 |
| 2.3.2 pET-Duet-lod-cat/BL21工程菌诱导表达 | 第53-55页 |
| 2.3.3 乳酸氧化酶和过氧化氢酶活性测定 | 第55页 |
| 2.3.4 pET-Duet-lod-cat/BL21发酵优化 | 第55-57页 |
| 2.4 结论 | 第57-58页 |
| 第三节 乳酸氧化酶和过氧化氢酶偶联制备丙酮酸 | 第58-67页 |
| 3.1 实验材料 | 第58页 |
| 3.1.1 菌种 | 第58页 |
| 3.1.2 实验药品与试剂 | 第58页 |
| 3.1.3 实验仪器 | 第58页 |
| 3.2 实验方法 | 第58页 |
| 3.2.1 湿菌体制备 | 第58页 |
| 3.2.2 乳酸氧化酶活性测定 | 第58页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第58-66页 |
| 3.3.1 反应温度对酶促反应影响 | 第58-59页 |
| 3.3.2 反应pH对酶促反应影响 | 第59-60页 |
| 3.3.3 乳酸氧化酶催化动力学 | 第60-61页 |
| 3.3.4 锥形瓶溶氧量对酶促反应影响 | 第61页 |
| 3.3.5 外源过氧化氢酶对丙酮酸积累的影响 | 第61-62页 |
| 3.3.6 EDTA和Fe~(2+)对丙酮酸积累的影响 | 第62-63页 |
| 3.3.7 菌体细胞浓度对丙酮酸积累的影响 | 第63-64页 |
| 3.3.8 双酶催化合成丙酮酸进程 | 第64-66页 |
| 3.4 结论 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-69页 |
| 第三章 多酶偶联生物合成L-酪氨酸 | 第69-79页 |
| 3.1 实验材料 | 第69-70页 |
| 3.1.1 菌种及培养基 | 第69-70页 |
| 3.1.2 试剂与仪器 | 第70页 |
| 3.2 实验方法 | 第70页 |
| 3.2.1 菌体培养及收集 | 第70页 |
| 3.2.2 全细胞合成L-酪氨酸 | 第70页 |
| 3.2.3 L-酪氨酸检测 | 第70页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第70-77页 |
| 3.3.1 温度对酶偶联反应的影响 | 第70-71页 |
| 3.3.2 pH对酶偶联反应的影响 | 第71-72页 |
| 3.3.3 双酶配比对酶偶联反应的影响 | 第72-73页 |
| 3.3.4 底物浓度配比对酶偶联反应的影响 | 第73-74页 |
| 3.3.5 乳酸浓度对酶偶联反应的影响 | 第74-75页 |
| 3.3.6 几种措施减轻底物抑制 | 第75-77页 |
| 3.4 结论 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-79页 |
| 第四章 牛肾氨基酰化酶分子改造 | 第79-90页 |
| 4.1 实验材料 | 第80页 |
| 4.2 实验方法 | 第80-82页 |
| 4.2.1 pET-Duet-bacy1/BL21构建 | 第80-81页 |
| 4.2.2 pET-Duet-xinew/BL21构建 | 第81页 |
| 4.2.3 蛋白表达及粗酶制备 | 第81页 |
| 4.2.4 氨基酸含量测定 | 第81页 |
| 4.2.5 氨基酰化酶活性测定 | 第81-82页 |
| 4.2.6 同源建模 | 第82页 |
| 4.3 实验结果 | 第82-87页 |
| 4.3.1 pET-Duet-bacy1质粒双酶切验证及工程菌蛋白表达 | 第82-84页 |
| 4.3.2 pET-Duet-xinew质粒双酶切验证及工程菌蛋白表达 | 第84页 |
| 4.3.3 粗酶酶学性质 | 第84-85页 |
| 4.3.4 底物特异性 | 第85-86页 |
| 4.3.5 同源建模和Docking | 第86-87页 |
| 4.4 结论 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-90页 |
| 总结 | 第90-91页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文与申请专利 | 第91-92页 |
| 附录A 2,4-二硝基苯肼比色法检测丙酮酸 | 第92-93页 |
| 附录B HPLC检测乳酸和丙酮酸含量 | 第93-94页 |
| 附录C 滴定法检测过氧化氢酶活性 | 第94-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
