| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-18页 |
| 1.1 脯氨酸氨肽酶 | 第9-12页 |
| 1.1.1 脯氨酸氨肽酶概述 | 第9页 |
| 1.1.2 脯氨酸氨肽酶的来源 | 第9-10页 |
| 1.1.3 脯氨酸氨肽酶的理化特性 | 第10-11页 |
| 1.1.4 脯氨酸氨肽酶的生理功能 | 第11页 |
| 1.1.5 脯氨酸氨肽酶的应用 | 第11-12页 |
| 1.1.6 脯氨酸氨肽酶的生产现状 | 第12页 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统 | 第12-14页 |
| 1.2.1 影响P. pastoris表达异源蛋白的因素 | 第13-14页 |
| 1.2.2 密码子优化 | 第14页 |
| 1.2.3 毕赤酵母的N-糖基化修饰 | 第14页 |
| 1.3 氨肽酶的稳定性 | 第14-15页 |
| 1.4 脯氨酸氨肽酶研究进展 | 第15-16页 |
| 1.4.1 国外研究概述 | 第15-16页 |
| 1.4.2 国内研究进展 | 第16页 |
| 1.5 立题意义 | 第16-17页 |
| 1.6 本论文研究内容 | 第17-18页 |
| 第二章 材料与方法 | 第18-25页 |
| 2.1 材料 | 第18-19页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第18页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第18页 |
| 2.1.3 培养基与溶液 | 第18-19页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第19页 |
| 2.2 方法 | 第19-24页 |
| 2.2.1 脯氨酸氨肽酶基因的克隆 | 第19页 |
| 2.2.2 氨肽酶的双酶切与连接反应 | 第19-20页 |
| 2.2.3 重组质粒热激转化E.coli及验证 | 第20页 |
| 2.2.4 P. pastoris感受态细胞的制备及电转化 | 第20页 |
| 2.2.5 重组P. pastoris的多拷贝筛选及表达验证 | 第20页 |
| 2.2.6 产P. pastoris毕赤酵母的诱导表达 | 第20-21页 |
| 2.2.7 含不同信号肽重组菌的构建及表达 | 第21页 |
| 2.2.8 脯氨酸氨肽酶核苷酸序列的优化及全基因合成 | 第21页 |
| 2.2.9 opt-pap基因组氨酸标签的添加 | 第21页 |
| 2.2.10 产脯氨酸氨肽酶酵母菌株的摇瓶发酵优化 | 第21-22页 |
| 2.2.11 opt-pap基因组氨酸标签的添加及氨肽酶的纯化 | 第22页 |
| 2.2.12 氨肽酶的酶学性质研究 | 第22-23页 |
| 2.2.13 麦谷蛋白的制备及脯氨酸氨肽酶对麦谷蛋白的水解初探 | 第23-24页 |
| 2.3 分析方法 | 第24-25页 |
| 2.3.1 PAP酶活标准测定方法 | 第24页 |
| 2.3.2 蛋白质浓度的测定 | 第24页 |
| 2.3.3 菌体浓度的测定 | 第24页 |
| 2.3.4 SDS-PAGE分析 | 第24页 |
| 2.3.5 质谱鉴定及圆二色谱分析 | 第24页 |
| 2.3.6 脯氨酸氨肽酶N-糖基化分析 | 第24-25页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第25-47页 |
| 3.1 表达脯氨酸氨肽酶酵母的构建 | 第25-28页 |
| 3.1.1 重组质粒pPIC9k-pap的构建 | 第25页 |
| 3.1.2 重组菌株GS115的构建 | 第25-26页 |
| 3.1.3 不同基因拷贝数重组菌株的筛选及诱导表达 | 第26-27页 |
| 3.1.4 不同信号肽对PAP表达的影响 | 第27-28页 |
| 3.2 密码子优化 | 第28-31页 |
| 3.2.1 A.oryzae与P. pastoris密码子偏好性的比较 | 第28-29页 |
| 3.2.2 脯氨酸氨肽酶基因pap的序列优化 | 第29-30页 |
| 3.2.3 酶切位点的取代及不同甲醇营养型重组子的比较 | 第30-31页 |
| 3.3 组氨酸标签的添加及一步纯化 | 第31-34页 |
| 3.3.1 组氨酸标签的添加 | 第31-32页 |
| 3.3.2 一步纯化与SDS-PAGE分析 | 第32页 |
| 3.3.3 质谱鉴定 | 第32-33页 |
| 3.3.4 纯化结果 | 第33-34页 |
| 3.4 重组毕赤酵母的摇瓶优化 | 第34-38页 |
| 3.4.1 生长曲线 | 第34页 |
| 3.4.2 诱导起始时间 | 第34-35页 |
| 3.4.3 甲醇添加量 | 第35-36页 |
| 3.4.4 诱导初始pH | 第36页 |
| 3.4.5 诱导温度 | 第36-37页 |
| 3.4.6 山梨醇浓度 | 第37-38页 |
| 3.5 毕赤酵母产PAP的酶学性质 | 第38-42页 |
| 3.5.1 最佳温度及温度稳定性 | 第38页 |
| 3.5.2 最佳pH及稳定性 | 第38-39页 |
| 3.5.3 耐盐性 | 第39-40页 |
| 3.5.4 储藏稳定性 | 第40页 |
| 3.5.5 金属离子及抑制剂 | 第40-41页 |
| 3.5.6 酶的动力学分析 | 第41-42页 |
| 3.5.7 对不同小肽底物的分解能力 | 第42页 |
| 3.6 糖基化分析 | 第42-44页 |
| 3.6.1 糖基化位点的预测及去糖基化处理 | 第42-43页 |
| 3.6.2 PAP的圆二色谱分析 | 第43-44页 |
| 3.7 麦谷蛋白的制备及氨肽酶的复配应用 | 第44-47页 |
| 3.7.1 麦谷蛋白的制备 | 第44页 |
| 3.7.2 复配酶解后的氨基酸含量多肽分布 | 第44-47页 |
| 主要结论与展望 | 第47-49页 |
| 主要结论 | 第47-48页 |
| 展望 | 第48-49页 |
| 致谢 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-55页 |
| 附录 1: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第55-56页 |
| 附录 2: 论文中所用标准曲线及麦谷蛋白水解液游离氨基酸含量 | 第56-57页 |
