| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 符号说明 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-19页 |
| 1 F18大肠杆菌(E. coli F18)致病机理及危害 | 第14-15页 |
| 1.1 产毒素性大肠杆菌致病机理 | 第14页 |
| 1.2. E.coli F18对养猪业的危害及研究进展 | 第14-15页 |
| 2 杀菌通透性增加蛋白(BPI)研究进展 | 第15-17页 |
| 2.1 BPI生物学功能及作用机理 | 第15页 |
| 2.2 猪BPI基因研究进展 | 第15-17页 |
| 3 DNA甲基化 | 第17-18页 |
| 3.1 表观遗传学和DNA甲基化 | 第17页 |
| 3.2 DNA甲基化检测方法 | 第17-18页 |
| 4 本研究的目的和意义 | 第18-19页 |
| 第二章 梅山猪仔猪BPI基因表达及其与E.coli F18抗性的关系 | 第19-27页 |
| 1 材料方法 | 第19-20页 |
| 1.1 试验材料 | 第19-20页 |
| 1.1.1 试验动物 | 第19-20页 |
| 1.1.2 主要试验仪器 | 第20页 |
| 1.1.3 主要试剂 | 第20页 |
| 2 试验方法 | 第20-22页 |
| 2.1 组织总RNA的提取准备工作 | 第20页 |
| 2.2 按照Trizol试剂盒说明书操作 | 第20-21页 |
| 2.3 RNA检测 | 第21页 |
| 2.3.1 浓度测定仪检测RNA | 第21页 |
| 2.3.2 琼脂糖凝胶的制备 | 第21页 |
| 2.3.3 RNA甲醛变性电泳检测 | 第21页 |
| 2.4 设计荧光定量引物 | 第21-22页 |
| 2.5 mRNA反转录 | 第22页 |
| 2.6 相对荧光定量PCR | 第22页 |
| 2.7 荧光定量结果分析 | 第22页 |
| 3 结果与分析 | 第22-25页 |
| 3.1 组织RNA的提取结果 | 第22-23页 |
| 3.2 目的基因熔解曲线 | 第23页 |
| 3.3 梅山猪BPI基因的组织表达谱分析 | 第23页 |
| 3.4 BPI基因在梅山猪不同发育时期十二指肠和空肠组织的差异表达 | 第23-24页 |
| 3.5 BPI基因在梅山仔猪E.coli F18抗性和易感型个体间十二指肠和空肠组织的差异表达 | 第24-25页 |
| 3.6 梅山及苏太断奶仔猪十二指肠和空肠组织中BPI基因表达差异分析 | 第25页 |
| 4. 讨论 | 第25-27页 |
| 第三章 BPI基因启动子区甲基化及其对mRNA表达水平和F18大肠杆菌抗性的影响 | 第27-54页 |
| 第一节 梅山猪和苏太猪BPI基因启动子区甲基化及其与mRNA表达水平的关系 | 第28-35页 |
| 1 试验材料 | 第28-29页 |
| 1.1 试验样本 | 第28页 |
| 1.2 主要试剂及实验仪器 | 第28页 |
| 1.3 相关试剂配制 | 第28-29页 |
| 1.4 LB培养基配制 | 第29页 |
| 1.4.1 液体LB培养基 | 第29页 |
| 1.4.2 LB固体培养基 | 第29页 |
| 1.5 准备DNA甲基化转化试剂盒 | 第29页 |
| 2 试验方法 | 第29-32页 |
| 2.1 猪BPI基因启动子区生物信息学分析及甲基化引物设计 | 第29页 |
| 2.2 BPI基因启动子区甲基化检测 | 第29-32页 |
| 2.2.1 亚硫酸氢盐处理 | 第29-31页 |
| 2.2.2 亚硫酸氢盐修饰的DNA进行PCR扩增 | 第31页 |
| 2.2.3 PCR产物纯化 | 第31页 |
| 2.2.4 目的片段与载体连接 | 第31页 |
| 2.2.5 转化感受态细胞 | 第31页 |
| 2.2.6 统计分析 | 第31-32页 |
| 3 试验结果 | 第32-33页 |
| 3.1 生物信息学分析 | 第32页 |
| 3.2 目的片段的扩增 | 第32-33页 |
| 3.3 BPI基因启动子区CpG岛区域甲基化程度及其与表达水平的相关性分析 | 第33页 |
| 4 讨论 | 第33-35页 |
| 第二节 BPI基因启动子区甲基化对断奶仔猪E.coli F18抗性的作用分析 | 第35-45页 |
| 1 试验材料 | 第35页 |
| 2 方法 | 第35-39页 |
| 2.1 DNA提取及亚硫酸氢盐处理 | 第35页 |
| 2.2 PCR扩增 | 第35页 |
| 2.3 1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 | 第35页 |
| 2.4 Illumina Miseq测序 | 第35页 |
| 2.5 建库 | 第35-38页 |
| 2.5.1 样品纯化 | 第35-36页 |
| 2.5.2 末端的修复 | 第36页 |
| 2.5.3 产物纯化 | 第36页 |
| 2.5.4 末端加A | 第36-37页 |
| 2.5.5 接头连接 | 第37页 |
| 2.5.6 纯化 | 第37-38页 |
| 2.6 上机测序 | 第38-39页 |
| 2.6.1 样品稀释变性,制备上机工作液 | 第38页 |
| 2.6.2 制备测序试剂盒 | 第38页 |
| 2.6.3 流动槽准备 | 第38-39页 |
| 2.6.4 试剂的装入及测序 | 第39页 |
| 2.7 处理序列 | 第39页 |
| 2.8 基因启动子区CpG岛转录因子结合位点分析 | 第39页 |
| 2.9 统计方法 | 第39页 |
| 3 结果与分析 | 第39-43页 |
| 3.1 目的片段的扩增 | 第39-40页 |
| 3.2 基因启动子区CpG岛Miseq测序质量和结果 | 第40-41页 |
| 3.3 苏太抗性和易感型仔猪肠道组织各个位点甲基化水平的比较分析 | 第41-42页 |
| 3.4 BPI基因扩增区域甲基化水平与mRNA表达量的相关性分析 | 第42-43页 |
| 4 讨论 | 第43-45页 |
| 第三节 苏太猪不同组织BPI基因启动子区甲基化及其与mRNA表达水平的相关性分析 | 第45-54页 |
| 1 试验材料 | 第45页 |
| 2 方法 | 第45-47页 |
| 2.1 BPI基因启动子区甲基化检测 | 第45页 |
| 2.2 凝胶迁移(EMSA)试验 | 第45-47页 |
| 2.2.1 探针设计合成 | 第45页 |
| 2.2.2 核蛋白提取 | 第45页 |
| 2.2.3 探针的标记 | 第45页 |
| 2.2.4 EMSA胶的配制(20ml 6%) | 第45页 |
| 2.2.5 EMSA结合反应 | 第45-46页 |
| 2.2.6 电泳 | 第46页 |
| 2.2.7 转膜 | 第46页 |
| 2.2.8 交联 | 第46页 |
| 2.2.9 化学发光检测 | 第46-47页 |
| 2.3 C/EBPβ表达水平检测 | 第47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-51页 |
| 3.1 基因启动子区CpG岛Miseq测序质量 | 第47-49页 |
| 3.2 BPI基因扩增区域甲基化水平与mRNA表达量的相关性分析 | 第49-50页 |
| 3.3 BPI基因PCR扩增序列生物信息分析 | 第50页 |
| 3.4 EMSA实验结果分析 | 第50-51页 |
| 3.5 C/EBPβ在苏太不相同组织中表达水平分析 | 第51页 |
| 4 讨论 | 第51-54页 |
| 全文结论 | 第54-55页 |
| 本试验的不足之处及下一步工作计划(展望) | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-64页 |
| 致谢 | 第64-65页 |
| 攻读学位期间发表学术论文 | 第65-66页 |
