| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第8-18页 |
| 1.1 L-苹果酸概述 | 第8-9页 |
| 1.1.1 L-苹果酸的性质及其应用 | 第8页 |
| 1.1.2 L-苹果酸的生产方法 | 第8-9页 |
| 1.2 一步发酵法生产L-苹果酸 | 第9-12页 |
| 1.2.1 L-苹果酸的生产菌株 | 第9-11页 |
| 1.2.2 L-苹果酸的生产路径 | 第11-12页 |
| 1.2.3 L-苹果酸的研究进展 | 第12页 |
| 1.3 代谢路径的优化策略及其研究进展 | 第12-15页 |
| 1.3.1 启动子工程 | 第12-13页 |
| 1.3.2 转运子工程 | 第13-14页 |
| 1.3.3 亚细胞定位工程 | 第14-15页 |
| 1.3.4 辅因子工程 | 第15页 |
| 1.4 本论文的立题依据和意义 | 第15-16页 |
| 1.5 本论文的研究内容 | 第16-18页 |
| 第二章 材料和方法 | 第18-29页 |
| 2.1 材料 | 第18-23页 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 | 第18-22页 |
| 2.1.2 工具酶和试剂 | 第22页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第22-23页 |
| 2.2 培养基和培养条件 | 第23-24页 |
| 2.2.1 培养基 | 第23页 |
| 2.2.2 培养条件 | 第23-24页 |
| 2.3 分析方法 | 第24-25页 |
| 2.3.1 细胞干重的测定 | 第24页 |
| 2.3.2 胞内关键酶活水平测定 | 第24页 |
| 2.3.3 有机酸的测定 | 第24-25页 |
| 2.3.4 荧光检测 | 第25页 |
| 2.4 重组菌株的构建 | 第25-29页 |
| 2.4.1 DNA基本操作 | 第25-26页 |
| 2.4.2 trp1、his3基因的敲除 | 第26-27页 |
| 2.4.3 关键基因的克隆及重组质粒的构建 | 第27页 |
| 2.4.4 Spmae的定点突变 | 第27-28页 |
| 2.4.5 S. cerevisiae过表达菌株的构建与验证 | 第28-29页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第29-48页 |
| 3.1 高效合成L-苹果酸rTCA途径的构建与优化 | 第29-36页 |
| 3.1.1 色氨酸、组氨酸、尿嘧啶三重营养缺陷型菌株thTAM的构建 | 第29-30页 |
| 3.1.2 基因Afpyc、Afmdh、Ropyc、Romdh的克隆和重组质粒的构建 | 第30-31页 |
| 3.1.3 Afpyc和Afmdh共表达对L-苹果酸积累的影响 | 第31-33页 |
| 3.1.4 Ropyc和Romdh共表达对L-苹果酸积累的影响 | 第33-34页 |
| 3.1.5 Afpyc、Afmdh、Ropyc和Romdh组合优化对L-苹果酸积累的影响 | 第34-35页 |
| 3.1.6 小结 | 第35-36页 |
| 3.2 重构C4-二羧酸转运系统对L-苹果酸积累的影响 | 第36-41页 |
| 3.2.1 重组质粒及工程菌株的构建 | 第36页 |
| 3.2.2 过量表达不同来源的苹果酸转运蛋白对苹果酸积累的影响 | 第36-38页 |
| 3.2.3 泛素化位点突变菌株的构建及其检测 | 第38-39页 |
| 3.2.4 Spmae突变体对L-苹果酸积累的影响 | 第39-40页 |
| 3.2.5 小结 | 第40-41页 |
| 3.3 不同表达水平（低、中、高）优化L-苹果酸合成路径 | 第41-48页 |
| 3.3.1 重组质粒及工程菌株的构建 | 第41-42页 |
| 3.3.2 关键基因的不同表达水平对L-苹果酸生产的影响 | 第42-44页 |
| 3.3.3 关键基因的不同表达水平对菌体生长及副产物的影响 | 第44-45页 |
| 3.3.4 不同接种量和硫胺素添加量对L-苹果酸积累的影响 | 第45-47页 |
| 3.3.5 小结 | 第47-48页 |
| 主要结论与展望 | 第48-50页 |
| 致谢 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-56页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第56页 |
