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代谢工程改造酿酒酵母rTCA路径和C4-二羧酸转运系统生产L-苹果酸

摘要第3-4页
Abstract第4-5页
第一章 绪论第8-18页
    1.1 L-苹果酸概述第8-9页
        1.1.1 L-苹果酸的性质及其应用第8页
        1.1.2 L-苹果酸的生产方法第8-9页
    1.2 一步发酵法生产L-苹果酸第9-12页
        1.2.1 L-苹果酸的生产菌株第9-11页
        1.2.2 L-苹果酸的生产路径第11-12页
        1.2.3 L-苹果酸的研究进展第12页
    1.3 代谢路径的优化策略及其研究进展第12-15页
        1.3.1 启动子工程第12-13页
        1.3.2 转运子工程第13-14页
        1.3.3 亚细胞定位工程第14-15页
        1.3.4 辅因子工程第15页
    1.4 本论文的立题依据和意义第15-16页
    1.5 本论文的研究内容第16-18页
第二章 材料和方法第18-29页
    2.1 材料第18-23页
        2.1.1 菌株、质粒和引物第18-22页
        2.1.2 工具酶和试剂第22页
        2.1.3 主要仪器第22-23页
    2.2 培养基和培养条件第23-24页
        2.2.1 培养基第23页
        2.2.2 培养条件第23-24页
    2.3 分析方法第24-25页
        2.3.1 细胞干重的测定第24页
        2.3.2 胞内关键酶活水平测定第24页
        2.3.3 有机酸的测定第24-25页
        2.3.4 荧光检测第25页
    2.4 重组菌株的构建第25-29页
        2.4.1 DNA基本操作第25-26页
        2.4.2 trp1、his3基因的敲除第26-27页
        2.4.3 关键基因的克隆及重组质粒的构建第27页
        2.4.4 Spmae的定点突变第27-28页
        2.4.5 S. cerevisiae过表达菌株的构建与验证第28-29页
第三章 结果与讨论第29-48页
    3.1 高效合成L-苹果酸rTCA途径的构建与优化第29-36页
        3.1.1 色氨酸、组氨酸、尿嘧啶三重营养缺陷型菌株thTAM的构建第29-30页
        3.1.2 基因Afpyc、Afmdh、Ropyc、Romdh的克隆和重组质粒的构建第30-31页
        3.1.3 Afpyc和Afmdh共表达对L-苹果酸积累的影响第31-33页
        3.1.4 Ropyc和Romdh共表达对L-苹果酸积累的影响第33-34页
        3.1.5 Afpyc、Afmdh、Ropyc和Romdh组合优化对L-苹果酸积累的影响第34-35页
        3.1.6 小结第35-36页
    3.2 重构C4-二羧酸转运系统对L-苹果酸积累的影响第36-41页
        3.2.1 重组质粒及工程菌株的构建第36页
        3.2.2 过量表达不同来源的苹果酸转运蛋白对苹果酸积累的影响第36-38页
        3.2.3 泛素化位点突变菌株的构建及其检测第38-39页
        3.2.4 Spmae突变体对L-苹果酸积累的影响第39-40页
        3.2.5 小结第40-41页
    3.3 不同表达水平(低、中、高)优化L-苹果酸合成路径第41-48页
        3.3.1 重组质粒及工程菌株的构建第41-42页
        3.3.2 关键基因的不同表达水平对L-苹果酸生产的影响第42-44页
        3.3.3 关键基因的不同表达水平对菌体生长及副产物的影响第44-45页
        3.3.4 不同接种量和硫胺素添加量对L-苹果酸积累的影响第45-47页
        3.3.5 小结第47-48页
主要结论与展望第48-50页
致谢第50-51页
参考文献第51-56页
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文第56页

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