| 摘要 | 第1-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 第1章 绪论 | 第14-22页 |
| ·延胡索酸简介 | 第14-16页 |
| ·延胡索酸的性质及其用途 | 第14-15页 |
| ·延胡索酸的生产方法和现状 | 第15-16页 |
| ·国内外研究进展 | 第16-17页 |
| ·代谢工程技术在工业微生物改造中的应用 | 第17-18页 |
| ·大肠杆菌基因工程菌构建技术研究进展 | 第18页 |
| ·课题研究的意义 | 第18-19页 |
| ·课题研究内容 | 第19-22页 |
| ·出发菌株的选择 | 第19页 |
| ·敲除延胡索酸还原酶frdB | 第19-20页 |
| ·异源表达丙酮酸羧化酶pyc | 第20页 |
| ·ptsG敲除对大肠杆菌发酵及生长特性的影响 | 第20-22页 |
| 第2章 高产琥珀酸大肠杆菌的筛选 | 第22-32页 |
| ·引言 | 第22-23页 |
| ·材料与仪器 | 第23-25页 |
| ·菌株材料 | 第23页 |
| ·主要试剂 | 第23-24页 |
| ·主要仪器 | 第24-25页 |
| ·培养基 | 第25页 |
| ·实验方法 | 第25-27页 |
| ·产琥珀酸菌株筛选方案 | 第25页 |
| ·菌种的初筛 | 第25-26页 |
| ·HPLC法复筛 | 第26-27页 |
| ·菌株鉴定 | 第27页 |
| ·结果 | 第27-31页 |
| ·溴甲酚绿平板初筛 | 第27-28页 |
| ·琥珀酸定性半定量测定结果 | 第28-29页 |
| ·HPLC法复筛结果 | 第29页 |
| ·菌株鉴定结果 | 第29-31页 |
| ·本章小结 | 第31-32页 |
| 第3章 frdB敲除对大肠杆菌产延胡索酸的影响 | 第32-52页 |
| ·引言 | 第32-33页 |
| ·实验材料 | 第33-36页 |
| ·菌株与质粒 | 第33页 |
| ·主要仪器 | 第33页 |
| ·分子生物学试剂与酶 | 第33-34页 |
| ·主要生化试剂 | 第34页 |
| ·培养基 | 第34-35页 |
| ·引物设计 | 第35-36页 |
| ·实验方法 | 第36-45页 |
| ·菌体培养与发酵方法 | 第36页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制作与转化 | 第36-38页 |
| ·大肠杆菌电感受态细胞的制备与转化 | 第38页 |
| ·质粒的提取 | 第38-39页 |
| ·大肠杆菌染色体DNA的提取 | 第39页 |
| ·PCR扩增与产物的纯化 | 第39-40页 |
| ·PCR片段和载体的双酶切 | 第40页 |
| ·载体与PCR片段的连接、转化 | 第40-41页 |
| ·Red同源重组缺失目的基因的一般步骤 | 第41-42页 |
| ·同源重组突变盒frdB：：cat的制备 | 第42-44页 |
| ·Red同源重组缺失frdB | 第44-45页 |
| ·大肠杆菌发酵产物的测定 | 第45页 |
| ·重组菌株生长的测定 | 第45页 |
| ·测定重组菌株的产酸能力 | 第45页 |
| ·实验结果 | 第45-51页 |
| ·带FRT位点氯霉素抗性同源片段frdB：：cat的制备 | 第45-46页 |
| ·frdB基因缺陷株的鉴定 | 第46-47页 |
| ·氯霉素抗性基因的消除与鉴定 | 第47-48页 |
| ·重组菌株在LB培养基中的生长 | 第48-49页 |
| ·重组菌株在LBG培养基中的生长 | 第49页 |
| ·大肠杆菌发酵产物的分析 | 第49-51页 |
| ·讨论 | 第51-52页 |
| 第4章 丙酮酸羧化酶对延胡索酸产量的影响 | 第52-68页 |
| ·引言 | 第52页 |
| ·实验材料 | 第52-53页 |
| ·菌株与质粒 | 第52-53页 |
| ·分子生物学试剂与酶 | 第53页 |
| ·主要仪器 | 第53页 |
| ·引物 | 第53页 |
| ·培养基 | 第53页 |
| ·方法 | 第53-58页 |
| ·培养方法 | 第53页 |
| ·丙酮酸羧化酶活性的测量 | 第53-54页 |
| ·枯草芽孢杆菌168基因组DNA的提取 | 第54页 |
| ·质粒pET-28a(+)的提取 | 第54-55页 |
| ·表达引物的设计 | 第55页 |
| ·大肠杆菌表达感受态细胞的制备与转化 | 第55页 |
| ·质粒pET-28a(+)-pyc的构建 | 第55-57页 |
| ·阳性重组子的检测验证 | 第57-58页 |
| ·阳性转化子的诱导表达与酶活验证 | 第58页 |
| ·实验结果 | 第58-65页 |
| ·质粒pET-28a(+)的提取 | 第58-59页 |
| ·丙酮酸羧化酶(pyc)基因的克隆 | 第59页 |
| ·质粒pET-28a(+)-pyc的构建 | 第59-62页 |
| ·丙酮酸羧化酶基因在大肠杆菌SPUEC105中的表达 | 第62-65页 |
| ·本章小结 | 第65-68页 |
| 第5章 ptsG敲除对大肠杆菌发酵及生长特性的影响 | 第68-76页 |
| ·引言 | 第68页 |
| ·实验材料 | 第68-69页 |
| ·菌株与质粒 | 第68页 |
| ·主要仪器 | 第68页 |
| ·分子生物学试剂与酶 | 第68页 |
| ·主要生化试剂 | 第68页 |
| ·培养基 | 第68-69页 |
| ·引物设计 | 第69页 |
| ·实验方法 | 第69-70页 |
| ·ptsG与pMD19 T-simple vector载体连接和转化 | 第69页 |
| ·对pMD-T-ptsG进行PCR克隆 | 第69-70页 |
| ·氯霉素抗性基因及FRT位点的克隆 | 第70页 |
| ·pMD-T-ptsG：：cat重组质粒的构建 | 第70页 |
| ·ptsG：：cat的克隆 | 第70页 |
| ·实验结果 | 第70-74页 |
| ·带FRT位点氯霉素抗性同源片段ptsG：：cat的制备 | 第70-71页 |
| ·ptsG基因缺陷株的鉴定 | 第71页 |
| ·氯霉素抗性基因的消除与鉴定 | 第71-72页 |
| ·重组菌株在LBG培养基中的生长 | 第72-73页 |
| ·大肠杆菌发酵产物的分析 | 第73-74页 |
| ·本章小结 | 第74-76页 |
| 第6章 结论与展望 | 第76-80页 |
| ·主要结论 | 第76-77页 |
| ·筛选到出发菌株SPUEC101 | 第76页 |
| ·构建frdB敲除菌SPUEC103 | 第76页 |
| ·表达丙酮酸羧化酶pyc | 第76-77页 |
| ·敲除ptsG基因 | 第77页 |
| ·展望 | 第77-80页 |
| ·有氧条件下的代谢调控基因的改造 | 第77-78页 |
| ·调控基因的识别和改造 | 第78页 |
| ·发酵工艺的优化与改进 | 第78-80页 |
| 参考文献 | 第80-86页 |
| 致谢 | 第86-88页 |
| 在学期间主要研究成果 | 第88页 |
