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产延胡索酸大肠杆菌代谢途径的改造

摘要第1-12页
ABSTRACT第12-14页
第1章 绪论第14-22页
   ·延胡索酸简介第14-16页
     ·延胡索酸的性质及其用途第14-15页
     ·延胡索酸的生产方法和现状第15-16页
   ·国内外研究进展第16-17页
   ·代谢工程技术在工业微生物改造中的应用第17-18页
   ·大肠杆菌基因工程菌构建技术研究进展第18页
   ·课题研究的意义第18-19页
   ·课题研究内容第19-22页
     ·出发菌株的选择第19页
     ·敲除延胡索酸还原酶frdB第19-20页
     ·异源表达丙酮酸羧化酶pyc第20页
     ·ptsG敲除对大肠杆菌发酵及生长特性的影响第20-22页
第2章 高产琥珀酸大肠杆菌的筛选第22-32页
   ·引言第22-23页
   ·材料与仪器第23-25页
     ·菌株材料第23页
       ·主要试剂第23-24页
       ·主要仪器第24-25页
       ·培养基第25页
   ·实验方法第25-27页
     ·产琥珀酸菌株筛选方案第25页
     ·菌种的初筛第25-26页
     ·HPLC法复筛第26-27页
     ·菌株鉴定第27页
   ·结果第27-31页
     ·溴甲酚绿平板初筛第27-28页
     ·琥珀酸定性半定量测定结果第28-29页
     ·HPLC法复筛结果第29页
     ·菌株鉴定结果第29-31页
   ·本章小结第31-32页
第3章 frdB敲除对大肠杆菌产延胡索酸的影响第32-52页
   ·引言第32-33页
   ·实验材料第33-36页
     ·菌株与质粒第33页
     ·主要仪器第33页
     ·分子生物学试剂与酶第33-34页
     ·主要生化试剂第34页
     ·培养基第34-35页
     ·引物设计第35-36页
   ·实验方法第36-45页
     ·菌体培养与发酵方法第36页
     ·大肠杆菌感受态细胞的制作与转化第36-38页
     ·大肠杆菌电感受态细胞的制备与转化第38页
     ·质粒的提取第38-39页
     ·大肠杆菌染色体DNA的提取第39页
     ·PCR扩增与产物的纯化第39-40页
     ·PCR片段和载体的双酶切第40页
     ·载体与PCR片段的连接、转化第40-41页
     ·Red同源重组缺失目的基因的一般步骤第41-42页
     ·同源重组突变盒frdB::cat的制备第42-44页
     ·Red同源重组缺失frdB第44-45页
     ·大肠杆菌发酵产物的测定第45页
     ·重组菌株生长的测定第45页
     ·测定重组菌株的产酸能力第45页
   ·实验结果第45-51页
     ·带FRT位点氯霉素抗性同源片段frdB::cat的制备第45-46页
     ·frdB基因缺陷株的鉴定第46-47页
     ·氯霉素抗性基因的消除与鉴定第47-48页
     ·重组菌株在LB培养基中的生长第48-49页
     ·重组菌株在LBG培养基中的生长第49页
     ·大肠杆菌发酵产物的分析第49-51页
   ·讨论第51-52页
第4章 丙酮酸羧化酶对延胡索酸产量的影响第52-68页
   ·引言第52页
   ·实验材料第52-53页
     ·菌株与质粒第52-53页
     ·分子生物学试剂与酶第53页
     ·主要仪器第53页
     ·引物第53页
     ·培养基第53页
   ·方法第53-58页
     ·培养方法第53页
     ·丙酮酸羧化酶活性的测量第53-54页
     ·枯草芽孢杆菌168基因组DNA的提取第54页
     ·质粒pET-28a(+)的提取第54-55页
     ·表达引物的设计第55页
     ·大肠杆菌表达感受态细胞的制备与转化第55页
     ·质粒pET-28a(+)-pyc的构建第55-57页
     ·阳性重组子的检测验证第57-58页
     ·阳性转化子的诱导表达与酶活验证第58页
   ·实验结果第58-65页
     ·质粒pET-28a(+)的提取第58-59页
     ·丙酮酸羧化酶(pyc)基因的克隆第59页
     ·质粒pET-28a(+)-pyc的构建第59-62页
     ·丙酮酸羧化酶基因在大肠杆菌SPUEC105中的表达第62-65页
   ·本章小结第65-68页
第5章 ptsG敲除对大肠杆菌发酵及生长特性的影响第68-76页
   ·引言第68页
   ·实验材料第68-69页
     ·菌株与质粒第68页
     ·主要仪器第68页
     ·分子生物学试剂与酶第68页
     ·主要生化试剂第68页
     ·培养基第68-69页
     ·引物设计第69页
   ·实验方法第69-70页
     ·ptsG与pMD19 T-simple vector载体连接和转化第69页
     ·对pMD-T-ptsG进行PCR克隆第69-70页
     ·氯霉素抗性基因及FRT位点的克隆第70页
     ·pMD-T-ptsG::cat重组质粒的构建第70页
     ·ptsG::cat的克隆第70页
   ·实验结果第70-74页
     ·带FRT位点氯霉素抗性同源片段ptsG::cat的制备第70-71页
     ·ptsG基因缺陷株的鉴定第71页
     ·氯霉素抗性基因的消除与鉴定第71-72页
     ·重组菌株在LBG培养基中的生长第72-73页
     ·大肠杆菌发酵产物的分析第73-74页
   ·本章小结第74-76页
第6章 结论与展望第76-80页
   ·主要结论第76-77页
     ·筛选到出发菌株SPUEC101第76页
     ·构建frdB敲除菌SPUEC103第76页
     ·表达丙酮酸羧化酶pyc第76-77页
     ·敲除ptsG基因第77页
   ·展望第77-80页
     ·有氧条件下的代谢调控基因的改造第77-78页
     ·调控基因的识别和改造第78页
     ·发酵工艺的优化与改进第78-80页
参考文献第80-86页
致谢第86-88页
在学期间主要研究成果第88页

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