| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-12页 |
| 第1章 绪论 | 第12-17页 |
| ·酰胺酶 | 第12-14页 |
| ·酰胺酶的分类 | 第12页 |
| ·酰胺酶的催化原理 | 第12页 |
| ·酰胺酶的底物特异性 | 第12-13页 |
| ·天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、哌嗪2甲酰胺酶概述 | 第13-14页 |
| ·基因组测序及分析 | 第14-16页 |
| ·基因组测序技术的发展 | 第14-15页 |
| ·基因组测序技术的研究进展 | 第15页 |
| ·基因组测序与基因资源发掘 | 第15-16页 |
| ·本课题的研究目的及意义 | 第16页 |
| ·本课题研究内容 | 第16-17页 |
| 第2章 马氏副球菌W10173基因组测序 | 第17-26页 |
| ·实验菌株 | 第17页 |
| ·实验方法 | 第17-18页 |
| ·测序结果分析 | 第18-25页 |
| ·序列拼接结果 | 第18页 |
| ·基因注释结果 | 第18-21页 |
| ·马氏副球菌W10173酰胺酶的分析 | 第21-25页 |
| ·小结 | 第25-26页 |
| 第3章 PM1509, PM1383, PM3012基因的克隆 | 第26-33页 |
| ·实验材料 | 第26-27页 |
| ·菌株来源及试剂 | 第26页 |
| ·主要仪器 | 第26页 |
| ·主要试剂配制方法 | 第26-27页 |
| ·主要培养基 | 第27页 |
| ·实验方法 | 第27-30页 |
| ·菌种的活化培养 | 第27页 |
| ·采用酚-氯仿法提取菌株基因组DNA | 第27-28页 |
| ·PM1509, PM1383, PM3012基因的PCR扩增 | 第28-29页 |
| ·PCR扩增产物与pMD18-T Vector的连接 | 第29页 |
| ·连接产物的转化 | 第29页 |
| ·重组子的验证 | 第29-30页 |
| ·实验结果与分析 | 第30-32页 |
| ·PM1509, PM1383, PM3012基因的引物设计及PCR扩增 | 第30-31页 |
| ·重组质粒大小检测 | 第31页 |
| ·重组子菌落PCR结果 | 第31-32页 |
| ·阳性重组子序列的测定 | 第32页 |
| ·小结 | 第32-33页 |
| 第4章 PM1509, PM1383, PM3012基因在E. coli的表达 | 第33-48页 |
| ·实验材料 | 第33-36页 |
| ·菌株和质粒 | 第33页 |
| ·主要工具酶及试剂 | 第33页 |
| ·主要仪器 | 第33-34页 |
| ·主要试剂的配制 | 第34-36页 |
| ·实验方法 | 第36-40页 |
| ·质粒提取 | 第36页 |
| ·重组质粒和质粒pET-28a(+)的双酶切 | 第36页 |
| ·目的基因片段与载体pET-28a(+)的连接 | 第36-37页 |
| ·感受态细胞的制备（无菌操作） | 第37页 |
| ·连接产物的转化 | 第37页 |
| ·重组子筛选与验证 | 第37页 |
| ·重组菌株的诱导表达 | 第37-38页 |
| ·蛋白标准曲线 | 第38页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第38页 |
| ·SDS-PAGE凝胶电泳 | 第38-39页 |
| ·包涵体的纯化及复性 | 第39-40页 |
| ·酶活测定方法 | 第40页 |
| ·实验结果与分析 | 第40-46页 |
| ·重组质粒及质粒pET-28a(+)的提取 | 第40页 |
| ·重组质粒的双酶切 | 第40-41页 |
| ·重组菌的验证 | 第41-42页 |
| ·重组菌序列的测定 | 第42页 |
| ·BSA蛋白标准曲线 | 第42页 |
| ·重组菌的诱导表达 | 第42-45页 |
| ·包涵体复性后酶活测定 | 第45-46页 |
| ·小结 | 第46-48页 |
| 第5章 PM2486, PM3475基因克隆及巴斯德毕赤酵母表达 | 第48-62页 |
| ·实验材料 | 第48-49页 |
| ·菌株和质粒 | 第48页 |
| ·主要工具酶及试剂 | 第48页 |
| ·主要仪器 | 第48页 |
| ·主要培养基及试剂配制 | 第48-49页 |
| ·实验方法 | 第49-52页 |
| ·PM2486和PM3475基因的克隆 | 第49-50页 |
| ·PM2486和PM3475基因表达载体的构建、验证和测序 | 第50页 |
| ·巴斯德毕赤酵母的电转化 | 第50-51页 |
| ·转化子的表型鉴定 | 第51页 |
| ·巴斯德毕赤酵母转化子的筛选验证 | 第51-52页 |
| ·PM2486和PM3475基因在巴斯德毕赤酵母中的真核表达 | 第52页 |
| ·发酵液上清蛋白含量的测定 | 第52页 |
| ·酶活测定 | 第52页 |
| ·实验结果与分析 | 第52-60页 |
| ·PM2486和PM3475基因的克隆 | 第52-53页 |
| ·重组载体pPIC9-PM2486和pPIC9-PM3475的构建 | 第53-55页 |
| ·巴斯德毕赤酵母的电转化结果 | 第55-57页 |
| ·巴斯德毕赤酵母转化子的诱导表达 | 第57-58页 |
| ·巴斯德毕赤酵母转化子表达蛋白酶活的测定 | 第58-59页 |
| ·转化子蛋白表达量的筛选 | 第59-60页 |
| ·PM2486-5 诱导表达SDS-PAGE检测 | 第60页 |
| ·小结 | 第60-62页 |
| 第6章 结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 | 第68页 |
