| 目录 | 第1-11页 |
| 中文摘要 | 第11-13页 |
| 英文摘要 | 第13-17页 |
| 前言 | 第17-20页 |
| 第一章 猪生长激素基因的cDNA克隆与原核表达 | 第20-54页 |
| 摘要 | 第20-21页 |
| 1 引言 | 第21-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-37页 |
| ·材料 | 第23-27页 |
| ·质粒和宿主菌 | 第23-24页 |
| ·主要试剂 | 第24-26页 |
| ·主要仪器设备 | 第26-27页 |
| ·培养基 | 第27页 |
| ·试验动物 | 第27页 |
| ·血清及抗原 | 第27页 |
| ·试验方法 | 第27-37页 |
| ·猪垂体总RNA的提取 | 第27-28页 |
| ·表达片段的PCR扩增 | 第28-29页 |
| ·pGH cDNA片段在pMD18-T中的克隆 | 第29页 |
| ·连接产物的转化 | 第29页 |
| ·重组测序质粒的筛选和鉴定 | 第29-31页 |
| ·原核表达质粒的构建 | 第31-33页 |
| ·融合蛋白的诱导表达及样品制备 | 第33页 |
| ·SDS-PAGE电泳分析 | 第33-34页 |
| ·从聚丙烯酰胺凝胶中分离回收融合蛋白 | 第34页 |
| ·抗血清的制备 | 第34-36页 |
| ·辛酸—硫酸铵法纯化抗体 | 第36页 |
| ·抗体含量测定 | 第36页 |
| ·抗体纯度分析 | 第36页 |
| ·垂体pGH的提取 | 第36-37页 |
| ·抗体鉴定 | 第37页 |
| 3. 结果与分析 | 第37-49页 |
| ·表达片段的PCR扩增反应 | 第37-38页 |
| ·重组质粒的构建及筛选 | 第38页 |
| ·pGH cDNA片段测序结果 | 第38-40页 |
| ·同源性分析 | 第40-43页 |
| ·原核表达质粒的构建及筛选 | 第43-45页 |
| ·融合蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析 | 第45-46页 |
| ·兔抗高免血清效价测定 | 第46页 |
| ·抗体纯化及含量纯度分析结果 | 第46-47页 |
| ·天然pGH提取结果 | 第47-48页 |
| ·抗体鉴定结果 | 第48-49页 |
| ·蛋白质印迹实验结果 | 第48-49页 |
| ·免疫组化结果 | 第49页 |
| 4 讨论 | 第49-52页 |
| ·pMD18-T载体的选择 | 第49页 |
| ·pGH基因差异分析 | 第49页 |
| ·pGEX4T-1载体的选择 | 第49-50页 |
| ·重组子pGEX4T-1/pGH的诱导表达 | 第50页 |
| ·兔抗pGH高免血清的制备 | 第50-51页 |
| ·辛酸—硫酸铵抗体纯化方法的选择及应用 | 第51-52页 |
| ·抗体的鉴定 | 第52页 |
| 5 小结 | 第52-54页 |
| ·克隆得到片段正确的pGH cDNA | 第52-53页 |
| ·成功构建pGH原核表达重组质粒，诱导表达正确 | 第53页 |
| ·制备了重组pGH的多克隆抗体 | 第53页 |
| ·验证了重组pGH抗血清的免疫特异性 | 第53页 |
| ·进行了pGH多克隆抗体的纯化 | 第53-54页 |
| 第二章 猪生长激素在酵母中的表达活性研究 | 第54-73页 |
| 摘要 | 第54页 |
| 1 引言 | 第54-55页 |
| 2 材料方法 | 第55-64页 |
| ·材料 | 第55-57页 |
| ·质粒和宿主菌 | 第55-56页 |
| ·主要试剂 | 第56页 |
| ·培养基 | 第56-57页 |
| ·仪器设备 | 第57页 |
| ·表达纯化所需溶液 | 第57页 |
| ·SDS-PAGE所需试剂 | 第57页 |
| ·Western印迹试剂 | 第57页 |
| ·方法 | 第57-64页 |
| ·酵母表达质粒的构建 | 第57-59页 |
| ·重组质粒对毕赤巴斯德酵母的转化 | 第59-61页 |
| ·阳性转化子的抗性筛选和鉴定 | 第61-62页 |
| ·转化子的再转化和筛选 | 第62-63页 |
| ·重组pGH基因工程酵母的诱导表达 | 第63页 |
| ·表达蛋白的收集 | 第63-64页 |
| ·表达产物的Western印迹分析 | 第64页 |
| 3 结果 | 第64-70页 |
| ·PCR结果 | 第64-65页 |
| ·酵母表达质粒的构建及筛选 | 第65-66页 |
| ·电击转化和筛选 | 第66页 |
| ·阳性转化子的总DNA PCR | 第66-67页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE | 第67-69页 |
| ·表达产物的Western印迹 | 第69-70页 |
| 4 讨论 | 第70-72页 |
| ·高表达应考虑以下几个问题 | 第70-71页 |
| ·表达载体 | 第71页 |
| ·外源基因在毕赤巴斯德酵母中的整合方式 | 第71-72页 |
| ·pGH正确表达 | 第72页 |
| 5 小结 | 第72-73页 |
| 第三章 pGH基因在哺乳动物COS_7细胞的转染表达 | 第73-88页 |
| 摘要 | 第73页 |
| 1. 引言 | 第73-76页 |
| 2 材料与方法 | 第76-83页 |
| ·材料 | 第76-78页 |
| ·质粒、宿主菌及真核细胞株 | 第76-77页 |
| ·主要试剂和设备 | 第77页 |
| ·ELISA所需溶液 | 第77-78页 |
| ·细胞培养所用试剂 | 第78页 |
| ·方法 | 第78-83页 |
| ·重组真核质粒的构建 | 第78-80页 |
| ·重组真核质粒VpGH的转染 | 第80-81页 |
| ·基因表达的检测 | 第81-83页 |
| 3 结果与分析 | 第83-85页 |
| ·重组真核质粒VpGH的构建及筛选 | 第83页 |
| ·重组质粒在转染后的RT-PCR检测结果 | 第83-84页 |
| ·pGH基因在COS_7细胞中表达产物的ELISA分析 | 第84-85页 |
| ·pGH转染的免疫荧光检测结果 | 第85页 |
| 4. 讨论 | 第85-87页 |
| ·哺乳动物细胞表达系统 | 第85-86页 |
| ·外源基因在哺乳动物细胞中的表达 | 第86-87页 |
| 5 小结 | 第87-88页 |
| 第四章 VpGH在动物体内的转染表达效应分析 | 第88-108页 |
| 摘要 | 第88页 |
| 1. 引言 | 第88-90页 |
| 2. 材料与方法 | 第90-95页 |
| ·材料 | 第90-91页 |
| ·VpGH基因制剂研究的材料 | 第90页 |
| ·pGH基因制剂在小鼠体内的表达 | 第90-91页 |
| ·方法 | 第91-95页 |
| ·VpGH基因制剂研究的方法 | 第91-93页 |
| ·pGH基因制剂在小鼠体内的表达的方法 | 第93-94页 |
| ·数据分析 | 第94页 |
| ·VpGH在小鼠组织基因组中的PCR检测 | 第94-95页 |
| ·小鼠攻毒试验 | 第95页 |
| 3. 结果 | 第95-105页 |
| ·VpGH基因制剂研究的结果 | 第95-96页 |
| ·质粒纯度测定结果 | 第95-96页 |
| ·包封率测定 | 第96页 |
| ·VpGH在小鼠体内的转染表达 | 第96-105页 |
| ·小鼠增重 | 第96-97页 |
| ·小鼠的免疫细胞数量变化 | 第97-100页 |
| ·不同处理小鼠的VpGH表达水平 | 第100页 |
| ·不同处理小鼠的IgG含量 | 第100页 |
| ·基因组PCR结果 | 第100-101页 |
| ·攻毒试验结果 | 第101-102页 |
| ·VpGH基因制剂对猪生长的影响 | 第102-105页 |
| 4. 讨论 | 第105-107页 |
| ·阳性脂质体介导转染法 | 第105-106页 |
| ·简化生产的工艺 | 第106页 |
| ·脂质体介导的转染表达重组质粒VpGH | 第106页 |
| ·猪生长激素安全问题 | 第106-107页 |
| 5 小结 | 第107-108页 |
| 总结 | 第108-109页 |
| 参考文献 | 第109-116页 |
| 文献综述 | 第116-149页 |
| 引言 | 第116-117页 |
| 1 猪生长激素基因的保守性 | 第117-118页 |
| ·pGH基因的定位和分子结构 | 第117-118页 |
| ·pGH基因保守性 | 第118页 |
| 2 猪生长激素基因的多态性 | 第118-121页 |
| ·pGH基因多变态 | 第118-120页 |
| ·PGH基因多态性与生产性能的相关 | 第120-121页 |
| 3 猪生长激素基因的生物学功能和作用机理 | 第121-125页 |
| ·生长激素对物质代谢的影响 | 第121-123页 |
| ·生长激素与蛋白质代谢 | 第121-122页 |
| ·生长激素与脂类代谢的影响 | 第122页 |
| ·GH对IGF-I、II和胰岛素分泌及葡萄糖浓度的影响 | 第122-123页 |
| ·生长激素与发育 | 第123页 |
| ·生长激素与骨 | 第123页 |
| ·生长激素对猪肉胴体组成的影响 | 第123页 |
| ·生长激素的作用方式 | 第123-125页 |
| ·神经内分泌轴 | 第123-124页 |
| ·胰岛素样生长因子(IGFs) | 第124页 |
| ·不依赖于胰岛素样生长因子-I(IGF-I)的直接作用 | 第124-125页 |
| ·依赖IGF-I的作用 | 第125页 |
| ·间接作用 | 第125页 |
| 4 猪生长激素基因的表达 | 第125-131页 |
| ·生长激素的原核表达 | 第125-126页 |
| ·生长激素的真核表达 | 第126-129页 |
| ·猪生长激素基因在昆虫细胞中的分泌表达 | 第127-128页 |
| ·猪生长激素在杆状病毒载体系统中的表达 | 第128页 |
| ·猪生长激素基因在酵母中的表达 | 第128-129页 |
| ·猪生长激素基因在大鼠体内的诱导表达 | 第129页 |
| ·猪生长激素cDNA基因在COS7细胞中的表达 | 第129页 |
| ·将猪生长激素基因直接转导到猪体内细胞中表达 | 第129-130页 |
| ·提高猪生长激素表达水平的主要方法 | 第130页 |
| ·猪生长激素抗体及其与猪生长激素的相互作用 | 第130-131页 |
| 5 影响猪生长激素作用的主要因素 | 第131-132页 |
| ·生长激素剂量 | 第131页 |
| ·动物因素 | 第131页 |
| ·日粮因素 | 第131-132页 |
| ·铜对生长猪肝中IGF-I基因 mRNA表达的影响 | 第132页 |
| 6 影响猪生长激素的应用前景 | 第132-138页 |
| ·猪生长激素使用的效益 | 第132-133页 |
| ·生长激素的制备 | 第133页 |
| ·脂质体的应用 | 第133-135页 |
| ·猪生长激素的使用方法 | 第135页 |
| ·注射法 | 第135页 |
| ·埋植法 | 第135页 |
| ·免疫法 | 第135页 |
| ·猪生长激素的安全问题 | 第135-138页 |
| 参考文献 | 第138-149页 |
| 致谢 | 第149-150页 |
| 研究生期间发表的论文 | 第150页 |
