| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 目录 | 第9-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-33页 |
| ·前言 | 第13-14页 |
| ·机械敏感性离子通道的研究进展 | 第14-22页 |
| ·机械敏感性离子通道的进化起源 | 第14-17页 |
| ·MS通道的分类 | 第17-18页 |
| ·MscL离子通道的进化与结构 | 第18-20页 |
| ·MscL的特点和功能 | 第20-21页 |
| ·MscL的门控机制 | 第21-22页 |
| ·天蓝色链霉菌中胁迫调节相关σ因子的研究进展 | 第22-30页 |
| ·S.coelicolor的胁迫调节相关σ因子 | 第25-28页 |
| ·S.coelicolor的anti-sigma factor | 第28-29页 |
| ·σ因子的调控基因 | 第29-30页 |
| ·研究内容 | 第30-33页 |
| 第二章 材料和方法 | 第33-61页 |
| ·菌种培养 | 第33-37页 |
| ·P-buffer | 第33页 |
| ·YEME(Yeast extract-malt extract)培养基 | 第33-34页 |
| ·R_5平板和R_5~-液体培养基 | 第34-35页 |
| ·微量元素储存液(Trace element solution,TES) | 第35页 |
| ·TSB培养基 | 第35页 |
| ·2×YT培养基 | 第35页 |
| ·孢子悬液制备 | 第35-36页 |
| ·菌落观察及其扫描电镜观察 | 第36页 |
| ·S.coelicolor原生质体制备 | 第36-37页 |
| ·抗生素测定 | 第37页 |
| ·基因操作 | 第37-44页 |
| ·S.coelicolor基因组提取 | 第37-38页 |
| ·链霉菌原生质体的转化(快速小量法) | 第38页 |
| ·基因敲除和突变株筛选 | 第38-39页 |
| ·回复突变体构建 | 第39-40页 |
| ·主要PCR程序 | 第40-41页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第41页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第41-42页 |
| ·大肠杆菌质粒提取及其DNA片断回收 | 第42页 |
| ·Southern blot试验操作 | 第42-44页 |
| ·大肠杆菌中蛋白表达和纯化 | 第44-47页 |
| ·大肠杆菌中表达目的蛋白 | 第44页 |
| ·大肠杆菌中目的蛋白表达形式的鉴定 | 第44页 |
| ·大肠杆菌中表达蛋白的纯化 | 第44-47页 |
| ·细胞生物学技术 | 第47-51页 |
| ·Top10感受态细胞的制备 | 第47-49页 |
| ·Top10感受态细胞的转化 | 第49页 |
| ·质粒提取 | 第49页 |
| ·细胞培养基本操作(以贴壁细胞为例) | 第49-50页 |
| ·脂质体中介的细胞转染(以24孔细胞培养板为例) | 第50-51页 |
| ·蛋白相互作用研究技术 | 第51-54页 |
| ·Pull down技术 | 第52页 |
| ·体内pull-down | 第52-53页 |
| ·细胞免疫荧光共定位技术 | 第53-54页 |
| ·哺乳动物细胞双杂交 | 第54页 |
| ·基因调控研究技术 | 第54-61页 |
| ·双向电泳(2-DE) | 第54-56页 |
| ·转录水平上的分析技术 | 第56-61页 |
| 第三章 渗透压胁迫条件下S.coelicolor生理反应研究 | 第61-79页 |
| ·引言 | 第61-62页 |
| ·材料和方法 | 第62-68页 |
| ·菌株及其培养 | 第62页 |
| ·试验方法 | 第62-68页 |
| ·结果和分析 | 第68-77页 |
| ·不同溶质低渗胁迫对S.coelicolor M145的存活率的影响 | 第68-69页 |
| ·NaCl低渗胁迫时间对S.coelicolor M145的存活率的影响 | 第69-70页 |
| ·NaCl低渗胁迫浓度梯度对S.coelicolor M145的存活率的影响 | 第70-73页 |
| ·NaCl低渗胁迫梯度对S.coelicolor的细胞相容性物质的影响 | 第73-77页 |
| ·讨论和小结 | 第77-79页 |
| 第四章 S.coelicolor中机械敏感性离子通道MscL的生化特性和生理功能研究 | 第79-105页 |
| ·引言 | 第79-80页 |
| ·材料和方法 | 第80-88页 |
| ·菌种和载体 | 第80页 |
| ·主要试剂 | 第80-83页 |
| ·主要仪器 | 第83页 |
| ·试验操作 | 第83-88页 |
| ·结果与分析 | 第88-103页 |
| ·Sc-MscL功能的生物信息学分析 | 第88-90页 |
| ·pKC-mlkmr构建过程 | 第90-91页 |
| ·Sc-mscl缺失突变体W2006的PCR鉴定和southern blot鉴定 | 第91-92页 |
| ·回复突变体的构建 | 第92-94页 |
| ·突变体W2006、野生型M145和回复突变体的形态发育对照 | 第94页 |
| ·scmscl缺失突变体W2006和野生型M145对抗低渗胁迫的反应对照 | 第94-96页 |
| ·scmscl缺失突变体W2006和野生型M145次生代谢对照 | 第96页 |
| ·scmscl基因的获得 | 第96页 |
| ·表达质粒的酶切鉴定 | 第96-98页 |
| ·表达质粒pGEX-Scmscl的测序鉴定 | 第98页 |
| ·体外表达GST-ScMscL和His-ScMscL | 第98页 |
| ·体外表达形式的鉴定 | 第98-99页 |
| ·表达蛋白的纯化及其凝血酶酶切获得单一的Sc-MscL蛋白 | 第99-100页 |
| ·Cross-linking试验探索ScMscL的功能聚合体 | 第100-101页 |
| ·体内表达ScMscL的western blot验证 | 第101页 |
| ·体内过量表达ScMscL对菌体生长和抗生素合成的影响 | 第101-103页 |
| ·讨论与小结 | 第103-105页 |
| 第五章 SigN对S.coelicolor形态发育及其胁迫调节作用的研究 | 第105-119页 |
| ·引言 | 第105-106页 |
| ·研究靶标SigN的确定 | 第106-108页 |
| ·利用B.subtilis的SigB对S.coelicolor的基因组进行搜索比对研究 | 第106页 |
| ·SigN生物信息分析 | 第106-108页 |
| ·材料与方法 | 第108-110页 |
| ·菌种和载体 | 第108页 |
| ·主要试剂和操作步骤 | 第108页 |
| ·引物和质粒构建 | 第108-110页 |
| ·sigN缺失突变体及其sigN回复突变体构建策略 | 第110页 |
| ·胁迫条件培养基的配制 | 第110页 |
| ·结果与讨论 | 第110-117页 |
| ·SigN缺失突变体的构建 | 第110-114页 |
| ·SigN缺失对S.coelicolor的生长及其次级代谢的影响 | 第114-117页 |
| ·讨论与小结 | 第117-119页 |
| 第六章 SigN的分子调控机制研究 | 第119-151页 |
| ·引言 | 第119-120页 |
| ·材料和方法 | 第120-126页 |
| ·菌株和质粒 | 第120页 |
| ·引物 | 第120页 |
| ·质粒构建 | 第120-123页 |
| ·试验方法 | 第123-126页 |
| ·结果与分析 | 第126-149页 |
| ·sigN,SCO5373的PCR及其表达质粒的构建 | 第126-128页 |
| ·In vivo pull down结合质谱测定分析与SigN相互作用的蛋白 | 第128-129页 |
| ·荧光共定位 | 第129页 |
| ·哺乳动物双杂交 | 第129-131页 |
| ·In vitro pull down分析 | 第131-132页 |
| ·胞内ATP水平分析 | 第132-133页 |
| ·S.coelicolor基因组酶切 | 第133页 |
| ·体外结合片段的获取 | 第133-134页 |
| ·生物信息学分析127个片段获得24个潜在的启动子序列 | 第134-136页 |
| ·24个潜在启动子的体外进一步验证 | 第136-137页 |
| ·RT-PCR结果 | 第137-138页 |
| ·双向电泳差异点分析 | 第138-145页 |
| ·RT-PCR验证调控基因 | 第145-148页 |
| ·Northern blot结果 | 第148-149页 |
| ·讨论和小结 | 第149-151页 |
| 结论与展望 | 第151-154页 |
| (1)天蓝色链霉菌的渗透压胁迫反应调节特性的研究 | 第151页 |
| (2)Sc-MscL对天蓝色链霉菌形态发育和次级代谢的调节作用 | 第151-152页 |
| (3)σ~N对天蓝色链霉菌的形态发育、次级代谢和胁迫反应应答的功能研究 | 第152页 |
| (4)σ~N的相互作用蛋白研究 | 第152页 |
| (5)σ~N的调控靶基因和间接调控的基因网络研究 | 第152-154页 |
| 缩略表 | 第154-155页 |
| 参考文献 | 第155-162页 |
| 附录 | 第162-171页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第171-172页 |
| 致谢 | 第172页 |
